Полный справочник медицинской аппаратуры - Коллектив авторов - Страница 45

Аппараты для иммуноферментного анализа (ИФА)

Любое вещество, обладающее свойствами антигена, полноценного или неполноценного (гаптена), можно количественно определить с применением иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА необходимо иметь очищенный антиген, специфическое для этого антигена антитело, фермент в качестве метки для антигена или антитела и средство (устройство) для регистрации активности фермента.

Реакцию ИФА можно проводить двояко. В первом случае из антигена, находящегося в тестируемом образце, и меченого антитела, добавленного в концентрации, превышающей концентрацию антигена, образуется комплекс антиген-меченое антитело. Количественно проанализировать такую реакцию можно по образованию комплекса антиген-меченое антитело, определяемого с помощью ферментной метки, или по меченому антителу, оставшемуся в несвязанном состоянии. Это неконкурентный вариант ИФА.

Во втором варианте лимитирующим субстратом является антитело. Меченый антиген при добавлении в анализируемый образец в известной концентрации связывается с антителом, образуя комплекс меченый антиген-антитело. В этой реакции меченый антиген будет конкурировать с немеченым антигеном, содержащимся в образце. Концентрация меченый антиген-антитело будет обратно пропорциональна концентрации антигена. Таким образом по заранее известной концентрации меченого антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена. Это конкурентный вариант ИФА. В обоих вариантах ИФА надо решить важную задачу – отделить связанную фракцию меченого реагента от несвя-завшегося, свободного реагента, чтобы определить долю специфического связывания.

Наборы иммунохимических реагентов для определения антигенов называются диагностикумами. Для их создания необходимо решить задачи получения антигена, антитела, комплекса антигена или антитела с ферментом, наладить регистрацию иммунохимиче-ской реакции по активности фермента, использованного в качестве метки. Кроме ферментов, в качестве меток для антигенов используют радиоактивные и флуоресцирующие соединения, такие реакции соответственно называются радиоиммунным и флуорес-центноиммунным анализом (РИА и ФИА). Предпочтением пользуется ИФА, поскольку он не требует сложной измерительной аппаратуры и применения радиоактивных соединений.

Иммунохимический анализ не ограничивается ИФА, РИА и ФИА, которые основаны на прямом взаимодействии антигена с антителом. Имеются другие методы обнаружения и количественного определения антигенов в зависимости от их физического состояния при взаимодействии с антителами. Если антиген расположен на поверхности клеток, то антитела вызовут слипание (агглютинацию) таких клеток. Этот принцип лежит в основе определения групп крови: склеивание эритроцитов при взаимодействии поверхностных антигенов с добавленными антителами – гемагглютинация. Антитела при добавлении в определенном соотношении к раствору макромолекулярных антигенов вызывают их преципитацию – образование крупных, визуально обнаруживаемых агрегатов из молекул антигена, связанных антителами. Во время проведения реакции преципитации в гелях возникают линии преципитации при образовании иммунных комплексов антиген-антитело, по форме этих линий можно судить о числе и иммунологическом родстве антигенов. Для идентификации белков широко применяется методика иммуноблоттинга: сначала смесь белков разделяют с помощью электрофореза в геле, затем на гель накладывают нитроцеллюлозную мембрану и на нее электрофо-ретически переносят (подвергают электроблоттингу) разделенные белки, которые идентифицируют посредством меченых антител. Меченые антитела широко используют в исследовании локализации компонентов клеток и тканей – это методы имму-ноцито– и иммуногистохимии. Клетки, меченные флуоресцирующими антителами, можно отделить от немеченых клеток – метод проточной цитофлуориметрии. Хроматографические колонки с сорбентом, с которым ковалентно связан антиген (или антитело), используются в аффинной хроматографии – отделении соответствующего антитела (или антигена) из смесей в результате образования иммунных комплексов. Еще одно применение иммунохи-мического анализа – иммуносенсоры: пьезокристалл, покрытый антигеном (антителом), в результате связывания антител (антигена) увеличивает свою массу и меняет частоту резонансных колебаний в переменном электрическом поле, что позволяет регистрировать изменение массы пьезоэлектрика порядка 10–12 г.

Таким образом, ИФА – это лишь один из способов определения антигенов, получивший широкое практическое распространение благодаря возможности количественных определений, высокой чувствительности и коммерческой доступности. В научно-исследовательской работе эти возможности иммунохимических методов всегда используются вместе с ИФА и даже с применением одних и тех же реагентов.

Возможности увеличения чувствительности ИФА ограничиваются фоном анализируемого соединения (т. е. его наличием не только в анализируемом образце, но и в используемых реактивах и растворителях), субстратной специфичностью фермента и аффинностью антител. К ограничениям ИФА относится также наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов. Еще один недостаток – ИФА не позволяет различать нативные белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты. Помехой для ИФА может быть изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном. Ограничением ИФА является его применимость лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифические антитела.

Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Поэтому сегодня ИФА находит широкое применение не только в здравоохранении, но и в различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе.

Любое заболевание человека и животных можно быстро и точно диагностировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при его патологических состояниях (рак, сердечно-сосудистые и эндокринные заболевания). Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений, наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, вирусных заболеваний растений, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений при отборе активных штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие вирусов-возбудителей СПИДа и гепатита В – это лишь небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии, онкологии трудно представить без ИФА. Реагенты для проведения ИФА сегодня стали коммерческими продуктами и могут быть приобретены по каталогам известных фирм.

Автоматизированные ИФА-анализаторы представляют собой модульную систему и состоят из автоматического дозатора образцов, сканера штрих-кода пробирок, промывочного блока, инкубатора, устройства для считывания оптической плотности частиц, блока для обработки результатов, представленного, как правило, персональным компьютером с соответствующим программным обеспечением.

Дозатор образцов используется для раскапывания образцов из пробирок на любые форматы исследуемых носителей – микропланшеты, пробирки, специальные картриджи, а также дозирования реактивов.

Образцы могут находиться в пробирках различных размеров и диаметров в зависимости от конструкции прибора. Многие ИФА-анализаторы оснащены датчиком детекции уровня жидкости образцов и реактивов и наличия сгустков, учитывая это, они могут использовать первичные пробирки с осажденным (но не удаленным) сгустком и эритромассой.